牦牛乳口感香浓，发酵具有“高浓度、牦牛高比重、乳菌高含量”的种筛特点，发酵牦牛乳是选及一种以牦牛奶为原料，经杀菌、加工接种发酵剂发酵制成的工艺传统饮品。发酵乳的优化质量优劣与牛奶种类、乳固形物含量、发酵牛奶理化特性及发酵剂等因素密切相关。牦牛为得到品质更好的乳菌发酵乳，多种菌株发酵是种筛发酵乳的讨论热点，许荣誉等研究发现约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌具有耐强酸的选及能力和良好的发酵特性；于素素等发现含有发酵乳杆菌的发酵牦牛乳具有良好的性能及风味；Rodriguezl等用约氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵牛乳，比普通发酵乳具有更好的加工物质代谢率。发酵乳的工艺口感与牛奶种类也有关系，研究发现，牦牛奶脂肪和干物质含量高导致其发酵制品存在质地硬、香味不足等缺点。为提高单一乳发酵制品的品质，国外常把山羊奶与荷斯坦牛奶或水牛奶混合后发酵。

为开发优质的发酵牦牛乳制品，本研究从10株乳酸菌中筛选适合牦牛乳发酵的3株菌，并与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌制成发酵剂。根据牦牛乳高蛋白质和高脂肪的特点，加入荷斯坦牛奶混合发酵，弥补单一牦牛乳发酵制品中存在的膻味较重、质地较硬等问题，为生产高品质牦牛发酵乳提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

牦牛乳（香格里拉高山牧场）；菌株：保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳 杆菌，副干酪乳杆菌，婴儿双歧乳杆菌，约氏乳杆菌，发酵乳杆菌，罗伊氏乳杆菌。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵乳菌株筛选

将10种乳酸菌株分别接种到10mL灭菌MRS培养基中，于37℃恒温培养活化。活化后的菌种接种到脱脂牛乳中驯化增殖，菌种接种量为6%、4%、2%，40℃下恒温培养至凝乳。通过测定发酵乳的酸度、乳酸菌数、凝乳时间确定适宜发酵菌种。

1.2.2 复合菌种配比

根据前期试验，将经1.2.1试验筛选出的3种菌株与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比1:1:1:1:1进行驯化（该比例下菌株协调共生，发酵性能最佳）。将驯化后的菌种按5%的添加量接种到脱脂奶粉培养基（含2%pH值6.86的PBS，2%番茄汁、6%胡萝卜汁、8%马铃薯汁）中培养至凝乳，加入冷冻干燥保护剂（20mL/L甘油、8g/L葡萄糖、20g/L抗坏血酸）于-80℃冻结后于-50℃、1~3MPa冷冻干燥72h，制成直投式复合发酵剂，于-20℃冰箱内冷藏备用。

1.2.3 发酵乳加工工艺设计

原料乳→预热（50~60℃）→均质（8～10MPa）→杀菌（85℃巴氏杀菌，10~20min）→冷却→接种→灌装→发酵→冷藏后熟→成品。

1.2.4 牦牛奶与荷斯坦牛奶的比例确定

将牦牛奶、荷斯坦牛奶分别按3:1、2:1、1:1、1:2、1:3比例加工制作为发酵乳，测定其感官评分，pH值、酸度、黏度及持水率，以确定最佳配比。

1.2.5 发酵乳工艺单因素试验

以发酵乳感官评分为指标，分别研究糖添加量（8%、8.5%、9%、9.5%、10%）、菌种添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、发酵温度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、发酵时间（20h，25h、30h、35h、40h）四个因素对其的影响。

1.2.6 发酵工艺优化

在单因素试验的基础上，采用响应面Bo x —Behnken试验设计，选取糖添加量、菌种添加量、发酵温度、发酵时间进行4因素3水平响应面分析，在中心值重复3次，以发酵乳感官评分为指标优化工艺参数。

1.3 测定指标

1.3.1 感官评分

组织10人评价小组，从色泽、气味、滋味及组织状态四个方面对发酵乳进行打分，评分标准如表1所示。

1.3.2 发酵牦牛乳理化指标测定

pH值：使用PHSJ-3F型pH计直接测定；持水力：参照Hassan的方法进行测定；酸度：参照GB 5009.239-2016进行测定；蛋白质：参照GB5009.5-2016进行测定；脂肪：参照GB5009.6-2016进行测定。

1.3.3 发酵牦牛乳风味成分双乙酰的测定

用三氯乙酸溶液将样品稀释后，取10支试管加入0.0、2.0、4.0、6.0﹑8.0mL标准液（各2支），用蒸
馏水补足至10mL后，加入5mL三氯乙酸溶液。一组加0.5mL邻苯二胺溶液，另一组做空白对照，暗处放
置30min后在335nm波长下测定吸光值。双乙酰含量（mg/L）=吸光度×1.2（换算系数）[10,11]。

1.3.4 发酵牦牛乳微生物指标检测

乳酸菌计数：参考GB4789.35-2016；大肠菌群计数：参考GB4789.3-2016；霉菌、酵母计数：参考GB4789.15-2016。

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